BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA YENİ GENETİK MÜHENDİSLİĞİ YÖNTEMİ VAZGEÇİLMEZ BİR ARAÇ.

    BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA YENİ GENETİK MÜHENDİSLİĞİ

    Restriksiyon enzimleri, modern biyolojik araştırmalarda devrim yaratan rekombinant DNA teknolojisi için gerekli araçlardır, ancak dizi özgünlüğü ve bulunabilirliği sınırlıdır. Suni kısıtlama enzimleri (ARE) üretmek için kullanılan Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) tabanlı platform, neredeyse herhangi bir rastgele bölgedeki DNA sekanslarını tanıyıp parçalayabilir ve değişen uzunlukta tanımlanmış yapışkan uçlar üretebilir.

        Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Profesörü Huimin Zhao ve Illinois Üniversitesi lisansüstü öğrencisi Behnam Enghiad'ın araştırması, temel ve uygulamalı biyolojik araştırma ve tıp için yeni bir genetik mühendisliği yönteminin öncülüğünü yapmaktadır. 6 Şubat'ta ACS Sentetik Biyolojide rapor edilen çalışmalar, dilimlenmiş DNA'nın hassasiyetini ve yapışkanlığını arttırarak genetik araştırmalarda yeni kapılar açma potansiyeline sahip. İllinois, Genomic Biology Carl R. Woese Enstitüsü'nde sentetik bir biyoloji araştırma grubunun liderliğini yürüten Zhao, “Teknolojimizi kullanarak, hemen hemen her dizi spesifikliği ve değişen uzunluğa sahip tanımlanmış yapışkan uçları ile son derece aktif suni kısıtlama enzimleri yaratabiliriz” dedi. “Bu, biyoteknolojide, arzulanan bir biyolojik fonksiyonun veya reaktifin mantıklı bir şekilde kolaylıkla ve kesin olarak tasarlandığı nadir bir örnektir.”

        Restriksiyon enzimleri genomik araştırmada önemli bir araçtır: DNA'yı belirli bir yerden keserek yabancı DNA'nın gen düzenleme amaçlı girilebileceği bir alan yaratırlar. Bu işlem sadece doğal olarak ortaya çıkan kısıtlayıcı enzimler tarafından sağlanır; Diğer suni kısıtlama enzimleri veya ARE'ler son yıllarda önem kazanmıştır. Kesme ve yapıştırma için kullanılan bir bakteri bağışıklık sistemi olan CRISPR-Cas9 ve modifiye edilmiş restriksiyon enzimleri olan TALEN'ler bu tekniklerin en popüler iki örneğidir.

        Genetik mühendisliğinde yararlı olmasına rağmen, hiçbir ARE "tanımlanmamış" yapışkan uçlar "(DNA merdiveninde eşit olmayan bir kırılma) oluşturur; bu yapı, tamamlayıcı çıkıntıları bırakır, yeni DNA'yı tanıtıyorsa yapışmayı geliştirir. Enigiad, "Aynı kısıtlama enzimi ile iki farklı DNA örneğini parçalayabilirseniz, yapışkan bitkiler tamamlayıcıdır" diye açıkladı. “Bir ligaz kullanırsanız, onları birbirine yapıştırabilirsiniz.”

        Bununla birlikte, kısıtlama enzimlerinin kendileri kritik dezavantaja sahiptir: kesilmelerini sağlayan tanıma dizisi çok kısadır (genellikle sadece dört ila sekiz baz çiftidir). Araştırmacılar, kesme alanı organizmalarının veya plazmidlerinin genomlarında yalnızca bir kez görülen bir kısıtlama enzimi bulmaya güveniyorlar (eldeki DNA binlerce baz çift uzunluğunda olabileceği zaman çoğu kez zor bir öneri).

        Bu problem, keşfedilen kısıtlayıcı enzim sayısıyla basitçe kısmen çözülmüştür: 3600'den fazla karakterize edilmiş ve 250'den fazla ticari olarak mevcuttur. Enghiad, "Sadece dondurucuda, diğer araştırmalarımızda, muhtemelen 100'den fazla farklı enzim var" dedi. "Her şeyi bir araya getirmek istediğimizde hepsine bakarız... Benzersiz kısıtlama alanını bulma şansı çok düşüktür.

        “Yeni teknolojimiz tüm bu kısıtlama enzimlerini bir protein ve iki DNA kılavuzundan oluşan tek bir sistemde birleştiriyor. Sadece bunları değiştirdiğiniz gibi, artık mevcut hiçbir kısıtlama enziminin kullanamadığı siteleri hedefleyebilirsiniz.”

        Enghiad ve Zhao'nun yeni tekniği, bir archeal türü olan Pyrococcus furiosus'tan alınan bir Argonaute proteini (PfAgo) kullanılarak ARE'ler oluşturur. Bir DNA rehberinin öncülüğünde PfAgo, kesim yerini bulurken özgüllüğü artırarak ve sınırlama enzimlerinin önündeki engellerin çoğunu ortadan kaldırırken çok daha uzun dizileri tanıyabiliyor. Ayrıca, PfAgo, diğer ARE'lere kıyasla, kısıtlama enzimlerinden daha uzun yapışkan uçlar oluşturabilir, bu da önemli bir fayda sağlar.

        Enghiad, " Başlarken, ilgili bir protein TtAgo ile ilgili bir makaleden esinlenildim. DNA'yı yarmak için bir DNA kılavuzu kullanabilir, ancak sadece 70 dereceye kadar" diye açıkladı. "DNA iplikçikleri 75 dereceden daha fazla ayrılmaya başlıyor, bu da bir proteinin yapışkan uçlar oluşturmasına izin verebilir. Eğer yüksek sıcaklıklarda aktif bir protein olsaydı, bu protein yapay bir kısıtlama enzimi olarak kullanılabilir."O yüzden aramaya başladım ve bulduğum şey PfAgo'ydı."

        Enghiad ve Zhao, genetik mühendisliği süreçlerinde restriksiyon enzimlerinin yerini almanın yanı sıra, teknolojilerinin biyolojik araştırmada geniş uygulama alanları olacağına inanıyor. Keyfi yapışkan uçlar yaratarak, PfAgo, büyük DNA moleküllerinin daha kolay bir şekilde birleştirilmesini sağlayabilir ve biyokimyasal yollar ve büyük genler gibi büyük DNA moleküllerinin klonlanmasını sağlanabilir.

        Bu tekniklerin uygulanması geniş kapsamlı: yeni küçük moleküllü ilaçların keşfinden, yakıtların ve kimyasalların sentezi için mikrobiyal hücre fabrikalarının mühendisliğine, Zhao ve Enghiad'ın şu anda aradığı alanlar olan genetik hastalıkların ve patojenlerin moleküler teşhisine kadar değişiyor.

        "Eşi benzeri görülmemiş kolaylık ve programlanabilirlik (tek bir protein artı hedefleme için DNA kılavuzları) ve erişilebilirlik nedeniyle ... PfAgo tabanlı ARE'lerin tüm sınırlama enzimi veya nükleaz etkin biyoteknolojik uygulamalarda güçlü ve vazgeçilmez bir araç haline gelmesini bekliyoruz "dedi Zhao.

    Daha fazla:Behnam Enghiad et al, Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes, ACS Synthetic Biology (2017). DOI: 10.1021/acssynbio.6b00324

    Çeviri: Celal DEMİRTAŞ

    Yayınlama tarihi: 16.02.2017

    Referans Dergi:ACS Synthetic Biology

    Provided by: University of Illinois at Urbana-Champaign

.
.